壳聚糖作为一种非病毒基因载体，由于具有良好的生物相容性、优异的生物降解性、高阳离子密度和低毒性等特点，被广泛认为是一种理想的基因载体。研究发现，水溶液中壳聚糖能使磷脂双层形成囊泡，直接破坏磷脂双层疏水核心的结构，还能打开上皮细胞间的紧密连接，便于大分子物质通过上皮组织的运转。不同相对分子质量的壳聚糖/DNA复合物对细胞的转染率一般比裸DNA、磷酸钙法及聚L-赖氨酸/DNA复合物高，但比商品化的转染试剂lipofectamine低。影响壳聚糖纳米粒体内外转染效果的因素有多种，主要和复合物颗粒大小、壳聚糖的相对分子质量、壳聚糖和DNA的N/P比（壳聚糖的氨基和DNA的磷酸基之比）、pH、血清的浓度及壳聚糖的脱乙酰度等因素有关。复合物颗粒大小直接影响在体内运输和向靶细胞进入，从而影响基因的转染率。研究认为，15 kDa和52 kDa的壳聚糖聚合物能极大地提高荧光素酶质粒(pGL3)对人肺癌A549细胞的转染率，相对分子质量大于100 kDa的转染率比它们低，而七聚物(1.3kDa)没有荧光素酶表达。此外，壳聚糖的脱乙酰度也是一种重要因素，因为它影响DNA的结合、释放和基因在体内外的转染率。脱乙酰度降低，DNA和壳聚糖的结合率降低，要形成完全的DNA复合物必须要有更高的N/P比。壳聚糖作为基因递送载体，不同条件下对DNA的释放有较大的影响，研究报道，在肝磷脂存在下高分子壳聚糖保持稳定，而在聚合度为18的壳聚糖和肝磷脂共同保温条件下，可降解并释放DNA，释放的DNA几乎保持完全的超螺旋，平均聚合度为18的壳聚糖在高电荷比条件下和DNA能形成稳定复合物，而且效率较高。
壳聚糖衍生物作为基因载体的研究
为了提高壳聚糖/DNA复合物的转染率以使其更具有靶向性，人们对壳聚糖进行了修饰。
①半乳糖基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇(G-CP)。
研究报道，将半乳糖基和壳聚糖相连能使其对肝细胞具有靶向性，但缺点是转染率很低。用半乳糖基低分子壳聚糖(Gal-LMWC)作为载体，结果表明，转染率随N/P比值的增大而增大，比值为5.6：1时达到最大值，因为半乳糖基密度增大时，复合物更容易和细胞表面的受体相互作用，从而提高转染率。Gal-LMWC/DNA对HepG2细胞的转染率比HeLa细胞高，表明基因对肝细胞的转染是通过受体介导的细胞内吞途径。和其他载体相比，GAL-LMWC/DNA在HepG2细胞中的转染率比裸DNA、CaP/DNA、HMWC/DNA、LMWC/DNA高，而比lipofectamine/DNA低。
②季铵化壳聚糖。
首先利用壳聚糖寡聚物(<20个单体)合成三甲基壳聚糖(TMO)，再用季铵化为40%(TMO-40)和50%(TMO-50)分别和质粒DNA形成复合物，以DOTAP(一种阳离子脂质体转染试剂)相对照，对COS-1细胞的转染结果为：DOTAP/DNA比裸DNA的转染率高；壳聚糖寡聚物的转染率是裸DNA的2～4倍；TMO-40/DNA显示比TMO-50/DNA高的转染率，配比为6:1和14:1时比裸DNA分别提高26倍和131倍。在10%的胎牛血清的培养基中DOTAP/DNA复合物的转染率显著降低，而对TMO/DNA复合物的影响不大，对TMO-40的影响小于对TMO-50的影响。壳聚糖和三甲壳聚糖与DOTA相比无细胞毒性，而DOTAP使细胞活性降低50%。TMO/DNA复合物对HepG2细胞有特异的靶向性，可能通过复合物和细胞表面的半乳糖受体相互作用。
③壳聚糖/DNA-配体复合物。
向壳聚糖/DNA复合物引入针对特定细胞表面受体的配体是提高转染率的又一方法。比如转铁蛋白受体，这一系统基于转铁蛋白受体介导的细胞内吞作用将外源基因转入细胞而得到比较高的转染率，不同细胞系转染率不同。
④烷基化壳聚糖。
首先制得十二烷基壳聚糖，与DNA通过静电相互作用形成复合物。由于十二烷基壳聚糖的保护作用，DNA分子热稳定性提高。DNA酶解实验表明，原始DNA酶解成碎片，而被十二烷基壳聚糖保护的DNA保持完好。
⑤脱氧胆酸改性的壳聚糖(DAMC)。
脱氧胆酸是胆汁酸的主要成分，由于胆汁酸可在水中自缔合，所以脱氧胆酸改性的壳聚糖也可自聚集形成平均直径为160 nm的胶囊。当N/P比为4:1时壳聚糖自聚体与质粒DNA间即可形成复合物，粒径在130～300 nm之间。以脱氧胆酸壳聚糖介导质粒DNA对COS-1细胞(猴肾细胞)的转染率高于裸DNA，但低于lipofectamine试剂。
⑥咪唑烯酸修饰的壳聚糖。
咪唑丙烯酸(uA)和可溶性壳聚糖通过酯化反应得到咪唑丙烯酸修饰的壳聚糖(UAC)，N/P比在5～30之间的复合物DNA可抵抗脱氧核糖核酸酶I(DnaseI)降解而得到很好的保护。UAC/DNA复合物平均直径小于100 nm，生理条件下复合物颗粒变大。但在高N/P值下，可形成150 nm左右的颗粒而满足要求。N/P增大，zeta电位升高，比值大约为3时，可完全屏蔽DNA的负电荷，uA在UAC中含量增高，zeta电位增高。UAC对293T细胞(人肾上皮细胞系的一种)的生存能力没有影响，且uA含量增加，细胞的生存能力提高，UAC对其它细胞的毒性也可忽略。对293T细胞的转染率随N/P比的增大而升高，复合物的转染率随着uA取代的增加显著升高，但UAC/DNA复合物对HeLa细胞和MCF-7细胞的转染率没有升高，对NCTC3749细胞只有微弱的升高，表明该壳聚糖/DNA对细胞的转染有细胞特异性。
⑦两性聚乙二醇壳聚糖。
乙二醇壳聚糖经酸解得到不同相对分子质量的聚合物，再结合十六烷酰基，其中一些附加N-甲基季铵基聚合度为22时，N/P比为2:1或更高时，DNA和载体能完全结合，粒径为200～500 nm。含有N-甲基季铵基的载体，其浓度为10 mg/ml时也没有溶血性。乙二醇壳聚糖由于降解及十六烷酰基的引入而产生细胞毒性，由于N-甲基的引入而恢复其生物相容性。降解的乙二醇壳聚糖/DNA复合物的转染率仅在A431细胞系(上皮癌细胞)中比阳离子脂质体高，但有N-甲基季铵离子的复合物在A431和A549(肺腺癌细胞)细胞系中都高于阳离子脂质体。聚合度在73～171范围内有转染发生，聚合度再高则会影响复合物和细胞的结合，从而严重影响转染率。用含有N-甲基季铵离子的载体体内试验，最佳聚合度为86，在肝脏和心脏的基因表达水平都优于Exgen500(线性聚乙胺)和Superfect(一种阳离子聚合物，已经商品化)。
壳聚糖在基因治疗中的应用
近年来，壳聚糖及其衍生物作为核酸的非病毒载体受到了广泛的关注。壳聚糖可以通过分子主链中带正电的伯胺与DNA/RNA中带负电的磷酸基团之间的静电相互作用与核酸分子形成稳定的复合物。壳聚糖作为核酸递送载体，不仅可以保护治疗基因免受生理液体中内切酶的降解，还能延长核酸分子的半衰期，从而提高转染效率。
①递送DNA
壳聚糖被广泛用作DNA的递送载体。研究报道了一种用于DNA递送的核-壳结构三元复合物体系。该体系使用线性聚乙烯亚胺偶联解聚壳聚糖作为DNA包封核心，PEG和细胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPPs，序列为5~30个氨基酸)作为DNA包封外壳。该复合物通过带负电的壳层和带正电的核层之间的静电相互作用形成，展现出良好的单分散性，其平均粒径为120 nm，胶体稳定性好。通过在体外和体内实验对三元复合物进行了评估，结果显示该复合物具有较好核酸负载能力、细胞摄取能力及核酸转染效果。然而，该系统与核酸的相互作用不足，核酸递送的效率不佳。为了解决这一问题，有研究将壳聚糖引入聚乳酸-聚乙二醇(polylactic acid-polyethylene glycol，PLA-PEG)纳米粒子中，旨在提高DNA在纳米粒子中的包封效率，并增强对DNA酶解损伤的保护。实验结果显示，纳米粒子的生物相容性显著提高，DNA的释放得到改善，并且在乳腺癌MCF-7细胞中的基因转染能力显著增强，表明通过壳聚糖、PLA和PEG的协同作用，可实现这一目标。
②递送RNA
用于治疗应用的调节性非编码RNA分子可分为siRNA、微RNA(micro RNA，miRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)和反义RNA。这些分子容易被人血清中的核酸酶降解，导致生物利用度较低，并且无法通过带负电荷的细胞膜，单独使用受到极大的限制。壳聚糖的生物相容性及其阳离子性质使其成为RNA递送的潜在非病毒载体。研究人员针对壳聚糖的特定参数如分子质量、脱乙酰化程度和氮磷基团比，对RNA转染能力进行了深入研究，以提高壳聚糖基多聚物的RNA递送效率。为了进一步提升RNA的递送效率，研究人员通过化学修饰以及在壳聚糖上接枝多肽或聚合物的方式，增强复合物的细胞穿透能力。其中，合成或天然的细胞穿透肽(如组氨酸、TAT、TAT-trans、CGKRK、精氨酸、聚L-精氨酸和鱼精蛋白)的引入，不仅提升复合物穿透细胞膜的能力，还提升了复合物的稳定性，更有效地保护RNA免受血清蛋白酶的降解。结果显示，这类修饰显著增强了细胞对复合物的摄取，同时显著提高了核酸转染和基因沉默能力。
③递送CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，已逐渐被研究者所认可，并在生物学研究领域得到了广泛应用，如鉴定疾病靶点、构建细胞系模型、开发转基因动植物等。与此同时，人们正在探索其作为肿瘤治疗基因编辑工具的潜力。CRISPR/Cas9是由核酸酶Cas9蛋白和单个引导RNA组成的大分子复合物。无论是通过mRNA和单导RNA在细胞内递送合成表达核酸酶蛋白，还是直接递送CRISPR/Cas9核糖核蛋白，都需要合适的递送载体。虽然病毒载体以其高传递效率而闻名，但它们也存在固有缺点，如潜在的致癌风险、插入大小的限制以及大规模生产的挑战，这些都极大地限制了它们在CRISPR/Cas9传递中的应用。相比之下，壳聚糖具有更大的有效载荷，可以更有效地递送CRISPR/Cas9基因编辑工具。通过修饰富含壳聚糖的官能团，可以提高递送的靶向性，并有效保护细胞中的核酸酶蛋白。研究报道了一种包裹红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的壳聚糖载体。该载体具有高负载能力，可以将Cas9 RNP(一种带有聚谷氨酸肽标签的工程蛋白)和DNA供体递送到特定细胞进行基因编辑，还有研究开发了一种功能化反应性壳聚糖载体，可递送sgVEGFR2/Cas9质粒和紫杉醇用于肝癌治疗。
参考资料
[1]李华安,李志扬,林博涵,等.壳聚糖作为核酸递送载体在基因治疗中的研究进展[J].中国新药杂志,2025,34(07):713-719.
[2]赵雪,任慧霞.壳聚糖及其衍生物作为基因递送载体的研究进展[J].食品与药品,2006,(02):1-5.
作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。
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